上海自動(dòng)化儀表三廠近日，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)了一種名為uSpyCLIP的新型深度測(cè)序方法，該方法能夠高靈敏度、高信噪比地檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白在RNA上的結(jié)合位點(diǎn)。研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用這一技術(shù)，揭示了兩種目前應(yīng)用廣泛的Cas13核酸酶——Prevotella sp. P5-125 (Psp)Cas13b和Ruminococcus flavefaciens XPD3002 (Rfx)Cas13d的引導(dǎo)RNA依賴性以及非依賴性脫靶結(jié)合位點(diǎn)的特征，為未來RNA編輯、檢測(cè)和治療應(yīng)用中Cas13和引導(dǎo)RNA的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)。

　　上海自動(dòng)化儀表三廠該技術(shù)通過最小化RNA結(jié)合蛋白的融合標(biāo)簽設(shè)計(jì)，顯著降低了對(duì)目標(biāo)蛋白活性的干擾，在識(shí)別RNA結(jié)合位點(diǎn)時(shí)具有高靈敏性和高特異性。與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)在相同測(cè)序深度下能夠檢測(cè)到更多的結(jié)合位點(diǎn)，并且僅需1000個(gè)細(xì)胞即可完成RNA結(jié)合蛋白位點(diǎn)圖譜的測(cè)定。此外，uSpyCLIP技術(shù)依托磁珠進(jìn)行操作，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流程，可有效減少人工投入，整個(gè)檢測(cè)流程僅需兩天時(shí)間。

　　研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用uSpyCLIP技術(shù)，繪制了dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄組中的結(jié)合位點(diǎn)分布圖譜。結(jié)果顯示，dCas13的結(jié)合行為比先前預(yù)想的更為廣泛。研究同時(shí)對(duì)兩種dCas13-gRNA復(fù)合物的脫靶結(jié)合行為進(jìn)行表征和驗(yàn)證，證實(shí)dCas13蛋白的引導(dǎo)RNA非依賴性脫靶位點(diǎn)具有獨(dú)特的RNA識(shí)別位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和序列特征。對(duì)引導(dǎo)RNA依賴性脫靶位點(diǎn)的分析顯示，引導(dǎo)RNA的DR遠(yuǎn)端區(qū)和中部區(qū)域在決定結(jié)合特異性中具有關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，部分脫靶事件導(dǎo)致非靶標(biāo)基因的mRNA和/或蛋白質(zhì)水平發(fā)生變化，這表明基于dCas13或dCas13-效應(yīng)子融合蛋白的應(yīng)用，如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、RNA成像和RNA編輯，可能因脫靶結(jié)合而產(chǎn)生復(fù)雜的毒副作用。

　　上海自動(dòng)化儀表有限公司這一研究為檢測(cè)Cas13的脫靶結(jié)合位點(diǎn)提供了新的技術(shù)手段與研究策略，并深化了關(guān)于Cas13系統(tǒng)的認(rèn)知。隨著CRISPR–Cas13系統(tǒng)在臨床和體內(nèi)治療應(yīng)用中的推進(jìn)，確保其靶向特異性變得日益重要。該研究通過對(duì)dPspCas13b和dRfxCas13d兩種廣泛使用的Cas13效應(yīng)器的全面分析，上海自動(dòng)化儀表有限公司為特異性引導(dǎo)RNA的合理設(shè)計(jì)以及Cas13蛋白的工程改良提供了重要的理論支撐，對(duì)未來優(yōu)化Cas13和引導(dǎo)RNA設(shè)計(jì)